關(guān)于賽默飛（Thermo Fisher）7500實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)常用的染料，我們可以分為兩大類：DNA結(jié)合染料 和水解探針。以下是詳細(xì)的介紹和選擇指南：

一、賽默飛7500實(shí)時熒光定量PCR儀DNA結(jié)合染料

這類染料可以嵌入任何雙鏈DNA分子的溝槽中，一旦與DNA結(jié)合，就會發(fā)出強(qiáng)烈的熒光信號。其特點(diǎn)是“通用性強(qiáng)"、“成本低"、“實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單"。

1、SYBR Green I

工作原理： 在PCR反應(yīng)體系中免費(fèi)加入SYBR Green I染料。它會特異性地嵌入新合成的雙鏈DNA中。每擴(kuò)增一條DNA分子，就結(jié)合一個染料分子，熒光信號隨之增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)定量。

優(yōu)點(diǎn)：

經(jīng)濟(jì)實(shí)惠： 成本遠(yuǎn)低于探針法。

使用方便： 無需設(shè)計(jì)復(fù)雜的探針，只需設(shè)計(jì)引物即可。

通用性強(qiáng)： 適用于任何基因的qPCR檢測。

缺點(diǎn)：

特異性較低： 它會與任何雙鏈DNA結(jié)合，包括引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，可能導(dǎo)致假陽性信號，影響定量的準(zhǔn)確性。

不能進(jìn)行多重PCR： 通常只能使用一個熒光通道，無法在同一反應(yīng)管內(nèi)檢測多個靶標(biāo)。

在7500上的應(yīng)用： SYBR Green I的熒光信號通常被配置在FAM通道（常用的通道）進(jìn)行檢測。賽默飛的PowerUp SYBR Green Master Mix是其經(jīng)典配套試劑。

2、TaqMan 探針

工作原理：

探針完整時，報(bào)告基團(tuán)的熒光被淬滅基團(tuán)吸收，檢測不到熒光。

在PCR擴(kuò)增過程中，Taq酶發(fā)揮5‘ → 3’ 外切酶活性，將探針?biāo)狻?/span>

報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光。

優(yōu)點(diǎn)：

特異性高： 需要引物和探針三者同時與模板結(jié)合才能產(chǎn)生信號，極大地減少了非特異性擴(kuò)增帶來的干擾。

可進(jìn)行多重檢測： 可以對不同的靶基因設(shè)計(jì)不同的探針，標(biāo)記上不同顏色的報(bào)告熒光基團(tuán)（如FAM, VIC, NED, ROX等），在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢測多個靶標(biāo)。

缺點(diǎn)：

成本高昂： 探針的合成費(fèi)用較高。

設(shè)計(jì)復(fù)雜： 對探針的設(shè)計(jì)和優(yōu)化要求較高。

在7500上的應(yīng)用： 這是7500系統(tǒng)的強(qiáng)項(xiàng)。7500系統(tǒng)配備了多個熒光濾光片，可以同時檢測多種染料。常用的TaqMan探針染料組合包括：

FAM - 常用，藍(lán)色通道。

VIC / JOE / HEX - 綠色通道，常用于內(nèi)參基因。

NED / TAMRA / Cy3 - 黃色通道。

ROX - 通常作為被動參照染料，用于校正孔間誤差，不用于基因檢測。

二、如何選擇？

1、選擇SYBR Green I（染料法）當(dāng)：

預(yù)算有限，需要進(jìn)行大量篩查實(shí)驗(yàn)。

檢測的靶基因數(shù)量不多，且已擁有特異性很好的引物。

只是初步定性或相對定量，對定量的精準(zhǔn)度要求不是苛刻。

需要快速建立實(shí)驗(yàn)方法。

2、選擇TaqMan 探針（探針法）當(dāng)：

對結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性要求高（如病毒載量檢測、基因分型、等位基因鑒別）。

需要進(jìn)行多重PCR（如在同一個反應(yīng)中同時檢測目標(biāo)基因和內(nèi)參基因）。

實(shí)驗(yàn)背景復(fù)雜，可能存在非特異性擴(kuò)增。

已有成熟的、經(jīng)過驗(yàn)證的探針和引物序列。

無論使用哪種染料，在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)前，都必須進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，包括引物/探針的特異性驗(yàn)證、擴(kuò)增效率的測定以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。對于SYBR Green I法，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后必須進(jìn)行熔解曲線分析，以確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物是單一的特異性條帶，而沒有引物二聚體等非特異性產(chǎn)物。